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    核酸提取的操作與運用技巧
    發布日期:2022/11/8 16:30:25
    對于廣大的生物科研人員來說,養細胞、養細菌、提核酸等都是實驗室的常見操作,實驗操作費時費力,過程中可能還會遇到各種坑。
    核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),它是由許多核苷酸單體聚合成的生物大分子化合物,為生命的最基本物質之一。核酸的提取分別為DNA 提取和RNA提取,二者的提取原理大致相同,簡單來說分為細胞或者組織的裂解和核酸純化兩大步驟。
    核酸提取純化方法常用的有酚/氯(lü)仿抽提法、離心柱法、磁珠法等。
    1、酚/氯(lü)仿抽提法
    乙(xi)烯氯(lü)仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑,反復抽提,使蛋白質變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子,變性降解核蛋白,使DNA從核蛋白中游離出來。
    酚/氯(lü)仿抽提法的優點是成本較低,對實驗條件要求也不高。該方法的缺點也很明顯:由于使用了苯(fen)酚、氯(lü)仿等有機試劑,毒性較大,長時間操作對人員健康有較大影響;而且核酸的回收率較低,損失量較大。
    離心柱純化
    這里以DNA提取離心柱為例。離心柱結構主要是特殊硅基質吸附材料,能特異性吸附DNA,而RNA與蛋白質則會穿過。該方法能選擇性地吸附核酸而不吸附蛋白質及鹽,從而實現核酸與蛋白質及鹽的分離,是目前試劑盒提取廣泛使用的方法。
    該方法受人為操作因素影響小,提取DNA的純度穩定性很高;而且離心柱法提取DNA的純度比傳統酚氯(lü)仿法提取的要高。離心柱法其低廉的價格和相對便捷的操作,漸逐取代了傳統DNA提取方法,被高校科研所等市場普遍接受。
    該方法的缺點是需要較多的樣本,對于珍稀樣本則不適合采用此方法。當樣品過量時,需要反復進行離心,對樣品的提取效率較低,不便于高通量、自動化操作。與現代生物學實驗的高通量、自動化要求格格不入,特別是在基因診斷、疾病檢測、轉基因檢測等領域,離心柱法DNA提取需要大量的操作人員及儀器設備。當面對突發疫情時,更是需要有高通量的DNA提取設備與方法才能更有效準確的監測疫情、控制疫情。
    磁珠法
    磁珠法是一種固相載體可逆化固定(SPRI)的分離純化方法,主要原理為:在不同濃度的PEG(polyethylene glycol;聚乙二醇)中,會有不同片段大小的DNA吸附在磁珠的羧基修飾層上,這些DNA可以再溶解在水中,以此來洗脫回收。
    實驗使用的磁珠分為五層,由內而外依次為:聚苯乙(xi)烯材料的核心、超順磁材料(主要為四氧化三鐵)、第二層聚苯乙(xi)烯材料、第二層超順磁材料以及表面粗糙的羧基修飾層。粗糙的表面更利于核酸與羧基修飾層結合。該方法將純化介質包被在納米級的磁珠表面,通過介質對DNA的吸附,在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動,從而達到核酸與其它物質分離的目的。
    與其它集中方法相比,磁珠法具有無可比擬的優勢,包括:
    (1)提取靈敏度高 ,只需微量的樣本就可以完成對核酸的提取;
    (2)純化的純度高 ,磁珠與核酸的特異性結合能使核酸充分與雜質分離,使得提取的核酸純度高、濃度大;
    (3)能夠實現自動化、大批量操作,通過機器自動化完成操作,所需人力少,而且同時可以完成多個樣本的大批量操作。以32孔的核酸自動提取儀為例,用一個樣品的提取時間即可實現對最多32個樣品的處理,符合生物學高通量的操作要求,使得傳染性疾病爆發時能夠進行快速及時的應對。
    (4)操作簡單、用時短,整個提取流程只有四步,根據儀器不同,部分儀器提取時間可以縮短到30分鐘,大大提高了實驗效率;
    (5)安全無毒,不使用傳統方法中的苯、氯(lü)仿等有毒試劑,對實驗操作人員的傷害減少到最少,完全符合現代環保理念;
    近年來磁珠法已成為核酸提取的必備工具之一,也是核酸自動化提取設備的必備組件之一。對于實驗樣本量大,經常做實驗的實驗人員來說,自動核酸提取儀是一個不錯的選擇。而且對于各類核酸,不論是質粒DNA、基因組DNA,還是RNA等,一臺自動核酸提取儀都可以滿足實驗人員的提取要求。    

    目前自動核酸提取儀基本都能滿足大批量核酸提取的需求,對于不同的樣本(如全血、質粒、培養細胞、組織等)和核酸類型(基因組DNA,病毒DNA/RNA,質粒DNA等)等能適配,自動核酸提取儀相對傳統的酚氯(lü)仿法及離心柱法要方便便捷許多。


    山東博科-核酸提取儀

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